Utrecht University (logo) (logo)
Universitair Medisch Centrum Utrecht (logo)

Coming up

You are here: Home > Education > PhD > PhD thesis > 2016 > January > Meulenbroeks

Chantal Meulenbroeks

Tuesday 5 January 2016

Equine insect bite hypersensitivity: Pathogenesis, diagnosis and immunomodulation

Promotor: Prof. dr. V.P.M.G. Rutten & prof.dr T. Willemse
Defence: 5 January 2016

Summary
Staart- en maneneczeem (SME) is een veel voorkomende allergische huidaandoening bij paarden en pony’s en wordt veroorzaakt door de beten van kleine insecten behorende tot de Culicoides familie, ook wel knutten genoemd. Deze komen in Nederland alleen voor van april tot en met september, waardoor SME een zogenaamde seizoensgebonden aandoening is. Beten van Culicoides soorten kunnen hevige jeuk veroorzaken en door krabben, bijten en schuren ontstaan huidveranderingen (laesies) zoals, roodverkleuring, schilfering, korstvorming, verdikking van de huid en haarverlies. De klinische verschijnselen worden vaak gezien bij de staartwortel en de manenkam, vandaar de naam staart- en maneneczeem.
SME is een multifactoriële aandoening, waarbij de omgevingsfactoren en de genetische aanleg van het paard bepalend zijn voor de ontwikkeling van klinische symptomen. Tot op heden zijn er nog geen effectieve preventie- of behandelmethoden beschikbaar. Daarnaast is er grote behoefte aan een betrouwbare diagnostische test voor SME, dat momenteel uitsluitend op basis van de klinische verschijnselen wordt vastgesteld.

Immuunpathogenese van SME
De immuunpathogenese van SME berust op een combinatie van zogenaamde type-1 (IgE-gemedieerd) en type-4 (Th2-gemedieerd) overgevoeligheidsreacties en kent een sensibilisatiefase en een effectorfase.
Uit humaan onderzoek is bekend dat wanneer een individu voor het eerst in contact komt met allergenen (eiwitten, die een allergische reactie kunnen veroorzaken), de sensibilisatiefase, deze door antigeen-presenterende cellen (Langerhans cellen; LC) in de huid worden opgenomen en afgebroken tot kleine fragmenten (peptiden). Na migratie van de LC naar de lymfeklieren worden de allergene peptiden via MHC II moleculen (Major Histocompatibility Complex) op de LC aangeboden aan T cel receptoren (TCR) van naïeve T cellen. In homeostase is er in het immuun systeem een evenwicht tussen zogeheten T helper 1 (Th1) en T helper 2 (Th2) reacties, echter, de consensus is, dat in SME de naïeve T cellen zullen prolifereren en differentiëren tot met name Th2 cellen. Ook B cellen nemen allergenen op, verwerken ze en presenteren deze via hun MHC II moleculen aan de TCR op de Th2 cellen. De Th2 cytokines, de interleukines IL-4, IL-5 en IL-13, zijn verantwoordelijk voor proliferatie en differentiatie van de allergeen-specifieke B cellen tot IgE producerende plasmacellen. Tenslotte bindt het antigeen-specifieke IgE aan receptoren (FcεR1) op mestcellen en eosinofiele granulocyten in de huid en basofiele granulocyten in het bloed, waarmee de sensibilisatie fase is afgerond. In dit proefschrift hebben we onderzocht of het immunologisch milieu in de huid bij paarden en pony’s met SME ook daadwerkelijk meer in de richting vanTh2 verschoven is (hoofdstuk 3 en 4).
Als een gesensibiliseerd individu voor een tweede keer met het allergeen in aanraking komt, de effector fase, wordt het allergeen gebonden door meerdere allergeen-specifieke IgE antilichamen aan het oppervlak van mestcellen, eosinofiele en basofiele granulocyten (cross-linking). Deze cross-linking zorgt voor degranulatie: blaasjes in de cel gevuld met proinflammatoire componenten (componenten die ontsteking veroorzaken) zoals histamine, geven hun inhoud af aan de omgeving. De jeuk en zwelling die daardoor ontstaan, resulteren uiteindelijk in de klinische symptomen.
Naast B cellen en effector T cellen kunnen ook regulatoire T cellen (Treg) een rol spelen in allergische reacties, de mate waarin zij het effectief functioneren van B cellen, Th2 cellen en LC remmen, o.a. via IL-10 en TGFβ productie, bepaald uiteindelijk het ontstaan van klinische symptomen. In hoofdstuk 3, 4 en 5 van dit proefschrift hebben we onderzocht of Treg cellen een rol spelen bij de regulatie van immuunresponsen in SME.

Allergenen en diagnose
Diverse allergeen preparaten worden gebruikt om aan te tonen of een individu allergisch is. In het geval van SME zijn dat met name “whole body extracts” van Culicoides. Deze extracten bevatten meerdere allergene eiwitten die kunnen binden aan IgE in het serum en aan IgE op cellen in bloed en huid van pony’s met SME. De specificiteit van het allergeenbindende IgE voor die eiwitten kan variëren, waardoor het lastig is om aan te geven welk eiwit het belangrijkste is bij het ontstaan van SME. Uit een aantal studies met C. nubeculosus en C. sonorensis extracten waarin antigeen-specifieke IgE niveaus bepaald werden, bleek dat er weinig homologie is tussen de allergenen afkomstig van verschillende Culicoides soorten. In Nederland is C. obsoletus de meest voorkomende Culicoides soort, die ook op paarden gevonden wordt. Om die reden hebben wij onderzocht of IgE afkomstig van pony’s en paarden met SME sterker reageert met C. obsoletus extract dan met extracten van twee andere Culicoides soorten, C. nubeculosus en C. sonorensis.
Het gebruik van “whole body extracts” van knutten heeft nadelen omdat ze ook eiwitten bevatten die niets met SME te maken hebben, een mogelijke complicatie voor diagnostische testen. Individuele allergene eiwitten hebben dit probleem niet en zouden dus beter geschikt zijn voor diagnose en eventuele immunotherapie. Een aantal dominante C. obsoletus allergenen werden geïdentificeerd en als recombinante eiwitten tot expressie gebracht (Cul o 1 – Cul o 7). In hoofdstuk 5 van dit proefschrift hebben we onderzocht of pools van deze recombinante eiwitten antigeen-specifieke T cellen in vitro kunnen stimuleren.
Tot nu toe werd de diagnose SME gesteld door in opeenvolgende jaren, in het SME-seizoen, specifieke klinische symptomen vast te stellen. Huidtesten uitgevoerd met allergeen extracten van Culicoides insecten, bleken niet specifiek genoeg en slecht reproduceerbaar. In verschillende onderzoeken naar SME wordt gebruik gemaakt van in vitro testen, maar deze zijn nog niet geoptimaliseerd en gevalideerd voor routinematig gebruik in de diagnostiek. Voorbeelden van in vitro testen zijn de Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) gebaseerd op binding van allergeen-specifiek IgE aan Culicoides extracten, en cellulaire testen zoals de basofielen degranulatietest, gebaseerd op degranulatie van cellen na cross-linking van IgE. In dit proefschrift hebben we onderzocht welke van deze twee testen het best gebruikt kan worden als diagnostische test voor SME (hoofdstuk 2).

UVB bestraling en allergie
In muizen kan allergische contact dermatitis (ACD) worden geïnduceerd door middel van het aanbrengen van DNFB (dinitrofluorbenzeen) op de huid. Net als Culicoides allergenen wordt DNFB opgenomen door LC en stimuleert het antigeen-specifieke degranulatie van mestcellen en basofiele granulocyten door middel van IgE cross-linking. In dit muizenmodel kan de effector fase van ACD onderdrukt worden door voorafgaand aan sensibilisatie fase te bestralen met UVB (ultraviolet B), waardoor IL-10 producerende, antigeen-specifieke Treg cellen worden geïnduceerd, en daarmee tolerantie voor DNFB. In dit proefschrift hebben we onderzocht hoe deze antigeen-specifieke Treg worden geactiveerd tot het onderdrukken van ACD (hoofdstuk 6).
In de humane kliniek wordt UVB bestraling veelvuldig toegepast ter behandeling van huidaandoeningen zoals atopische dermatitis en psoriasis. In dit proefschrift hebben we dan ook in een pilot studie het potentiële effect van UVB bestraling bij staart- en maneneczeem onderzocht (hoofdstuk 7).

In dit proefschrift
Het onderzoek beschreven in dit proefschrift had tot doel meer inzicht te krijgen in de immunopathogenese van staart- en maneneczeem (SME) en daarmee aanknopingspunten voor verbetering van de diagnostiek. Daarnaast werd het potentieel immunomodulerende effect van UVB bestraling op de huid van muizen met ACD en van paarden met SME onderzocht.
In hoofdstuk 2 zijn in eerste instantie in een kleine groep paarden (10 met SME en 10 gezonde controles) C. obsoletus en de commercieel verkrijgbare C. nubeculosus en C. sonorensis extracten met elkaar vergeleken voor hun toepasbaarheid voor SME diagnostiek. De drie extracten zijn getest op hun vermogen om paardenserum IgE te kunnen binden in een ELISA en in Western blots, en op hun vermogen om basofielen degranulatie op te wekken. Het C. obsoletus extract gaf de beste resultaten in alle testen. Om praktische redenen is er voor gekozen in verder onderzoek de ELISA te testen in een groter aantal paarden. Dit heeft geresulteerd in een test met hoge sensitiviteit en specificiteit, die daarmee ook geschikt is als diagnostische test voor SME.
Hoofdstuk 3 beschrijft Culicoides-specifieke immuunreactiviteit in SME pony’s en gezonde controle dieren uit dezelfde leefomgeving, en zowel in het SME-seizoen als buiten deze periode (winter). Het gemiddelde C. obsoletus-specifieke IgE niveau van pony’s met SME was significant hoger dan dat van de controle pony’s en de niveaus in het SME seizoen bleken gelijk aan die in de winter. Dit geeft aan dat (a) de pony’s waarbij de diagnose SME was gesteld op basis van klinische verschijnselen, ook daadwerkelijk SME hebben, en (b) dat SME zowel in het SME-seizoen als in de winter kan worden gediagnosticeerd m.b.v. een IgE ELISA.
In het SME-seizoen werden er in de lesionale huid van de pony’s met SME histologische veranderingen gezien passend bij een Th2 immuunreactie, terwijl dit niet het geval was in niet-lesionale huid van deze dieren en in de huid van gezonde pony’s. Er werden geen verschillen gevonden tussen IFNγ, IL-4, IL-13, FoxP3 en IL-10 mRNA expressie tussen lesionale en niet-lesionale huid van pony’s met SME en ook niet tussen niet-lesionale huid en gezonde controle huid. Wel waren de IFNγ, CD3ζ (TCR marker) en IL-13 mRNA niveaus significant hoger in het SME-seizoen in vergelijking met het winter seizoen. Dit kan betekenen dat de cellen in de huid van zowel pony’s met SME als in de huid van gezonde controle pony’s geactiveerd zijn. Op basis van deze bevinding is het dan ook aan te bevelen om in het winterseizoen te meten, zodat de invloed van factoren anders dan van Culicoides, geminimaliseerd wordt. Verder zijn er geen verschillen gevonden in FoxP3 en IL-10 mRNA expressie, wat suggereert dat Treg cellen niet geactiveerd worden in de huid van pony’s met SME, noch in die van gezonde controle pony’s in het SME-seizoen.
In de experimenten beschreven in hoofdstuk 4 is onderzocht welke immunologische reacties er plaats vinden in de huid van pony’s met en zonder SME, na een locale injectie met C. obsoletus extract (stimulatie). De cellen in de huid van zowel gezonde pony’s als pony’s met SME werden pas 24 uur na stimulatie geactiveerd. De IL-4 mRNA expressie niveaus, maar niet de IL-4 eiwit productie, waren significant hoger in de huid van pony’s met SME ten opzichte van de gezonde controles. Dit geeft aan, dat het immuunreactiviteit in de huid meer in de richting vanTh2 verschoven is. In tegenstelling tot de heersende gedachte dat het immuunsysteem van gezonde (niet allergische) individuen niet zou reageren op allergenen, werd na stimulatie met allergeen in de huid van gezonde pony’s significant meer expressie van IFNγ mRNA en eiwit waargenomen, passend bij een immuunreactiviteit van het Th1 type. Gezonde pony’s lijken op deze wijze beschermd tegen de ontwikkeling van SME.
In Hoofdstuk 5 wordt verslag gedaan van onze experimenten die tot doel hadden te onderzoeken of pools (pool 1= cul o 1, cul o 2, cul o 5, en pool 2= cul o 3, cul o 5, cul o 7) van recombinant C. obsoletus allergenen in vitro in staat zijn om antigeen-specifieke T cellen te stimuleren. Beide pools induceerden IL-4 mRNA expressie door T cellen afkomstig van zowel pony’s met als zonder SME, maar er was geen verschil in productie van het cytokine zelf. Daarnaast was er alleen met pool 1 meer IL-4 mRNA waarneembaar in cellen afkomstig van pony’s met SME dan van gezonde pony’s. Pool 1 en 2 waren beiden in staat om IFNγ mRNA expressie en cytokine productie te induceren in gekweekte antigeen-specifieke T cellen afkomstig van zowel gezonde pony’s als pony’s met SME. Ook waren deze pools in staat om antigeen-specifieke Treg cellen afkomstig van beide diergroepen aan te zetten tot IL-10 productie. Daarom zijn deze recombinante antigenen interessante kandidaten voor nader onderzoek naar immunotherapie gericht op IFNγ en Treg activatie.
In hoofdstuk 6 is in een muizenmodel onderzocht of het onderdrukken van allergische contact dermatitis (ACD) met UVB bestraling afhankelijk is van de aanwezigheid van de EGF-like groeifactor amphiregulin (AREG). In een colitis (ontsteking van de dikke darm) muismodel was aangetoond, dat AREG via de receptor voor epidermale groeifactor (EGF) Treg cellen kan stimuleren tot onderdrukking van immuunreacties. In ons DNFB muizenmodel hebben we gezien dat, onder invloed van UVB bestraling, basofiele cellen en niet mestcellen de voornaamste producent zijn van AREG. Verder suggereren onze resultaten dat ook in dit model AREG bindt aan de EGF-receptor op antigeen-specifieke Treg cellen die verantwoordelijk zijn voor de onderdrukking van de ACD reactie. Hiermee is een nieuwe rol voor basofiele granulocyten in immuunregulatie aangetoond.
In een pilot experiment beschreven in hoofdstuk 7 hebben we onderzocht of UVB bestraling ook een gunstig effect heeft op SME en of dit AREG afhankelijk is. Na UVB bestraling van de huid van pony’s met SME en daaropvolgend een lokale stimulatie met het C. obsoletus extract, trad significant minder zwelling op in de bestraalde huid dan in niet-bestraalde huid. Dit suggereert dat UVB een gunstig effect kan hebben op de ontstekingsreactie in de huid van pony’s met SME.
Uit mRNA expressie analyse bleek verder, dat in de UVB behandelde huid zowel de Th1 als Th2 immuun reacties waren afgenomen. Er werd geen verschil gevonden in Treg cel activatie en AREG mRNA expressie tussen wel en niet bestraalde huid. Dit suggereert dat UVB bestraling geen Treg cellen kan activeren via AREG, waarmee het werkingsmechanisme van UVB bestraling op de ontstekingsreactie bij SME onduidelijk blijft. Het feit dat er minder significant zwelling optrad met UVB geeft aanleiding voor meer onderzoek naar de effecten van UVB behandeling bij SME.
Samengevat, is door de resultaten van het onderzoek meer inzicht verkregen in de immunopathogenese van SME. Daarmee is ook een bijdrage geleverd aan het identificeren van mogelijke therapeutische aangrijpingspunten en nieuwe mogelijkheden voor diagnostiek. We laten zien dat ELISA een geschikte diagnostische methode is voor het vaststellen van SME, zowel in winter als in zomer, en dat het gebruik van allergenen afkomstig van Culicoides soorten uit de leefomgeving van het paard, van groot belang is voor een juiste diagnose. Daarnaast dragen de resultaten ook bij aan het vinden van geschikte kandidaat (recombinante) allergene eiwitten voor immunotherapie als alternatief voor de bestaande behandelingsmogelijkheden van SME. Hoewel dit proefschrift bijdroeg aan nadere opheldering van het mechanisme van onderdrukking van allergisch contact dermatitis door UVB bestraling in een muizenmodel, kon het resultaat van een pilot experiment m.b.t. UVB bestraling in SME paarden nog geen uitsluitsel geven over de mogelijkheden van deze therapie in SME paarden.

Back